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三八节祭文(细菌纤维素)

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细菌纤维素
作者:Stanislaw Bielecki
20051
 
目录
摘要
1.前言
2.历史概述
3.细菌纤维素结构
4.化学分析和测定
5.产生菌
6.生理功能
7.细菌纤维素的生物合成
8.细菌纤维素的生物降解
9.生物技术生产
10.特性
11.应用
12.专利
13.展望和远景
参考
缩写
主题
 
1.前言
2.历史概述
3.细菌纤维素的结构
4.化学分析和测定
5产生菌
6.生理功能
7.细菌纤维素生物合成
7.1.纤维素前体合成
7.2.纤维素合成酶
7.3.生物合成机制
7.4.纤维素生物合成的基因基础
7.5.细菌纤维素合成控制
7.6.由A. xylinum的可溶多糖合成
7.7.由A. xylinum合成的细胞内和细胞外纤维素的作用
8.细菌纤维素的生物降解
9.生物技术生产
9.1.天然源分离和细菌纤维素产生菌株改进
9.2.发酵生产
9.3.体外生物合成
9.4.化学—酶合成
9.5.预期在未来应用的生产工艺
9.6.回收和提纯
10.特性
11.应用
11.1.科技应用
11.2.医学应用
11.3.食品应用
11.4.其它应用
12.专利
13.展望和前景
 
 
1.前言
纤维素是地球上*丰富的生物聚合物,公认是植物界的主要成分,但也代表微生物细胞外聚合物。细菌纤维素(BC)属于基础代谢的特殊产物并且是一种保护包被,而植物纤维素(PC)起着结构作用。
由细菌合成的纤维素是属于醋酸菌属(Acetobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和八叠球菌属(Sarcina(Jonas and Farah, 1998)。*有效的生产菌是革兰氏阴性、醋酸菌Acetobacter xylinum(重新分类为Gluconacetobacter xylinus, Yamada et al., 1997; Yamada, 2000),用于微生物基础和纤维素研究(Cannon and Anderson, 1991)
研究集中在生物聚合物合成机制及决定它实际应用的机构和特性(Legge, 1990; Ross et al., 1991)。细菌纤维素*重要特性之一是它的化学纯度,是它与通常伴有去除特别困难半纤维素和木质素的植物纤维素的区别。
因为这独特性质,是从超细网状结构产生的,因此,细菌纤维素发现在造纸、纺织品和食品工业以及在化妆品和医药中的生物材料的诸多应用(Ring et al., 1986)。这种多糖的广泛应用显然是根据生产规模及其价值决定的。因此,基础研究和菌株改良和生产工艺开发加强研究同时进行。
 
2.历史概述
1886年由A. J. Brown首次报道A. xylinum细胞外胶膜合成,细菌纤维素在20世纪后半期引起更大关注。Hestrin 等人(1947, 1954)开始应用A. xylinum作为模型菌集中研究细菌纤维素合成,证明休眠和冻干醋酸菌细胞在有葡萄糖和氧存在可以合成纤维素。随后Colvin (1957)在含无A. xylinum细胞提取物、葡萄糖和ATP的样品测到纤维素合成。在细菌纤维素合成研究的里程碑,在这评论中提出,不仅是细菌聚合物的生物起源,而且还有对植物所做的贡献,导致了在自然界*重要进程之一的了解。
真实的历史概述提出贯穿下面所有章节,包括参考。
 
3.细菌纤维素结构
在细菌纤维素广泛研究,细菌纤维素的化学性与植物纤维素一致,揭示纤维素是β—1,4无支链聚合物连接吡喃葡萄糖残余,但它的大分子结构和特性与后者不同(图1)细菌纤维素初生链聚集形成亚原纤维,宽约1.5 nm和薄的自然发生的纤维,只相当于某些植物形成层中和奎宁粘液中检测到的纤维素次级纤维。细菌纤维素亚纤维被结晶进入微纤维(Jonas Farah, 1998)。这些成束和之后成带(Yamanaka et al., 2000)。按Zaar (1977)带的大小是3–4 ()×70–80 nm (),Brown et al. (1976)3.2×133 nm,或按Yamanaka 等人. (2000),4.1×117 nm,而桦树或松树桨产生纤维素纤维宽度是两个数量级2–2和各为3.0–7.5×10 mm,微生物超细丝带更大1.4–4.0×10纤维素,它的长的范围1 to 9 µm,形成一
稠密网状结构(Figure 2),结合大量的氢来稳定(Figure 3)。细菌纤维素与它的培养对应物也有区别,在高结晶指数(60%以上)和不同的聚合程度,通常在2000 6000之间,(Jonas and Farah, 1998),但在某些情况甚至可达到16,000 20,000之间 (Watanabe et al., 1998b),而培养聚合物的平均聚合程度变化从13,000 t14,000 (Teeri, 1997)
 
1.植物纤维素“边饰微粒”纤维与细菌纤维素微纤维比较模式图(Iguchi et al., 2000; with kind permission)
2.静止培养A. xylinum得到的细菌纤维素膜扫描电子显微镜图像(a)和附着在纤维素带的细菌细胞(b
3.在纤维素中链外(a)和链内(b)氢键。
A. xylinum
细菌纤维素肉眼形态完全根据培养条件而定(Watanabe et al., 1998a;Yamanaka et al., 2000)。在静止条件下(图4)细菌积聚纤维素膜(S-BC)出现在营养培养基表面,是在氧气丰富的气液界面。纤维素亚纤维,在细菌细胞表面从直线序孔连续伸出、结晶成微纤维并强行深入生长培养基中。因此,皮革样薄膜供养A. xylinum细胞群,由重叠和绞合纤维素带组成,形成平行有秩平面(Jonas and Farah, 1998)
静止培养细菌纤维素临近索支和互相连接比搅拌培养产生的细菌纤维素更少、在一型不规律颗粒、星形和纤维索、在培养基中很好分散(图5(Vandamme et al., 1998)。在搅拌细菌纤维素网状索相互连接形成网格模式,并有粗略垂直和粗略平行定位(Vandamme et al., 1998)
4.在静止培养中形成的细菌纤维素膜。
5.在搅拌培养中形成的细菌纤维素小球。
搅拌纤维素和静止纤维素在三维结构之差异在扫描电子显微镜显而易见。静止纤维素纤维有更大扩展和一个交叉堆积在另一个上面。搅拌纤维素索被缠绕和弯曲(Johnson and Neogi, 1989)
此外,它们有更大横截面比静止纤维素纤维宽(0.1–0.2 µm)(通常是0.05–0.10 µm)。静止纤维素和搅拌纤维素之间的形态差异致使结晶度数不同、不同晶粒大小和纤维素I容量。
纤维素有两种常见结晶型,定为I II,由X光、核磁共振(NMR)、拉曼光谱和红外线分析来区别(Johnson Neogi, 1989)。已知在相对稳定纤维素I,多是由植物也可以由静止培养的A. xylinum合成,平行β-1,4-葡聚糖链是单向排列,而纤维素IIβ-1,4-葡聚糖链排列随意方式。它们多是反平行的并有大量氢键链接,这结果是使纤维素II有更高热稳定性。
搅拌细菌纤维素比静止细菌纤维素有更低结晶度指数和结晶更小(Watanabe et al.,1998a)。还注意到,在搅拌培养中合成的细菌纤维素发生大部分是纤维素II。在自然界,纤维素II只有几种生物合成(某些海藻、霉菌和细菌,像胃八叠球菌(Sarcina ventriculi))(Jonas and Farah, 1998);这种纤维素的工业生产是根据植物纤维素化学转换。
C-NMR(核磁共振)有可能揭示纤维素I的存在和I的两个独特的纤维素型(Watanabe et al., 1998a)。这些型发生在海藻、细菌和植物衍生的纤维素中。后者比细菌纤维素含有更少纤维素I(Johnson and Neogi, 1989)
纤维素I不可逆晶体转变到I改变X线和CP/MASC-NMR(核磁共振)光谱是因为在单元细胞中的差异。静止细菌纤维素比搅拌细菌纤维素含有更多纤维素I。已报道在搅拌细菌纤维素和静止细菌纤维素之间纤维素I的差异超过结晶度指数(Watanabe et al., 1998a),和大部分纤维素I是与晶体大小密切相关。
 
4.化学分析和测定
为了测定纤维素的结晶或非晶态,有几种直接染色用于线状β-1,4-葡聚糖是特异性的(Mondal and Kai, 2000)。都是荧光增白剂并形成色素-纤维素复合物,由范德华和/或氢键合来稳定。
这些染料之一是荧光增白剂卡尔科弗卢尔(Calcofluor)。这种直接染料不仅能使纤维素链可视,而且还能广泛用于初生纤维素链联合和结晶化研究(见章节7.3.2)
纤维素平均重量DPDP分布是用硝化纤维素样品通过高性能凝胶渗透来测定的(Watanabe et al., 1998a)
在搅拌培养条件下产生的微生物纤维素的网状结构和在静止培养形成的纤维素膜有条理分层结构之间的区别,在扫描电子显微镜图像显而易见(Johnson and Neogi, 1989)
为了区分来自纤维素II反平行之一的纤维素I平行链结晶格,可应用X线衍射、拉曼光谱、红外线分析和核磁共振(Johnson and Neogi, 1989)。结晶度指数和结晶大小是根据X线衍射测量值来计算的(Watanabe et al., 1998a)。纤维素I有两个独特型,即纤维素IIX线衍射不能区分、因此CP/MAS核磁共振分析,在冻干纤维素样品进行,对这大量组分进行判断(Watanabe et al., 1998a)
纤维素的理化特性像容水能力、分解纤维素悬液的粘度和干膜Young's系数是应用常规方法测定的(Watanabe et al., 1998a, Iguchi et al., 2000)
 
5.产生菌
细菌纤维素是由几个菌属合成的,其中醋酸菌株(Acetobacter)**。纤维素生产菌概述见表1. (Jonas and Farah, 1998)。聚合物的结构是根据微生物而定的,虽然它的生物合成路径和它的调节机制在大部分细菌纤维素产生细菌可能是共同的(Ross et al., 1991;Jonas and Farah, 1998)
Table 1. BC producers (Jonas and Farah, 1998, modified)
GenusCellulose structure
Acetobacte rextracellular pellicle composed of ribbons
Achromobacter fibrils
1.细菌纤维素产生菌(Jonas and Farah, 1998, modified)
菌属                纤维素结构
醋酸菌属(Acetobacte          胞外丝带组成薄膜
无色菌属(Achromobacter      原纤维
气杆菌属(Aerobacter          原纤维
土壤杆菌属(Agrobacterium     短小纤维
产碱杆菌属(Alcaligenes        原纤维
假单胞菌属(Pseudomonas      不明显小纤维
根瘤菌属(Rhizobium           短小纤维
八叠球菌属(Sarcina            无定型纤维素
动胶菌属(Zoogloea            尚未确定
A. xylinum(同义词A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus),是纤维素*有效产生菌,近来重新分类并包括在新奇菌属葡糖酸醋酸菌属(Gluconacetobacter)中,木葡萄酸醋杆菌(G. xylinus(Yamada et al., 1998, 2000)和某些其它菌属((G. hansenii, ropaeus, G. oboediens, and G. intermedius).)一起。
 
6.生理功能
在自然栖息地,大部分细菌合成胞外多糖,在细胞周围形成包封(Costeron,1999)。细菌纤维素就是这样物质的一个例子。纤维素产生菌的细胞包封在聚合物网络之中,常常在液-气界面维持群聚(Wiliams and Cannon, 1989)。因此,细菌纤维素形成菌株能栖息在污水中(Jonas and Farah, 1998)。聚合物基质使部分细胞粘附于任何可接近的表面并促使营养提供,因为它们在聚合物格架中浓集,与周围水环境相比,由于它的吸附特性而明显增强(Jonas and Farah, 1998; Costeron, 1999)。某些作者设想,由A. xylinum合成的纤维素也可以起储存作用并能被饥饿微生物利用。它的分解是由外和内葡聚糖酶催化的,这种联合存在,在某些产生纤维素A. xylinum菌株的培养基中被检测到(Okamoto et al., 1994)
因为纤维素层的粘度和亲水特性,使产生的细菌在栖息地对不利变化(水容量减少、pH变化、毒性物质、病原微生物的存在、等)抵抗增强,并且它们在包膜内能进一步生长和发育。还发现细菌周围的纤维素使它们对紫外光的照射得以保护。在紫外光照射1小时处理,还有多达23%的醋酸菌细胞因为受细菌纤维素包裹而活存。如果去除保护多糖将使它们的活性急剧降低(只有3%(Ross
et al., 1991)
 
7.细菌纤维素的生物合成
细菌纤维素的合成是*和特异控制的多-步骤过程,涉及大量独特的酶和催化及调控蛋白复合物,其超分子结构迄今尚未明确界定。这些过程包括尿苷二磷酸葡萄糖(UDPGlc)合成,这是纤维素的前体,随后是葡萄糖聚合成β-1,4-葡聚糖链,和这初生链联合特征的带样结构,由数百或数千个别纤维素链构成。
UDPGlc合成的路径和机制已明确了解,而葡萄糖聚合成大的和无支链、它从细胞内挤出及自行组装成原纤维的分子机制,需要进一步阐述。
而且,细菌纤维素合成研究会有助于更好了解植物纤维素的生物起源。
7.1.纤维素前体的合成
A. xylinum的纤维素合成是碳代谢的*终产物,取决于细胞介入戊糖磷酸盐循环或克雷布斯循环的生理状态、与糖异生耦合(6) (Ross et al., 1991; Tonouchi et al., 1996)糖酵解在醋酸菌不起作用,因为它们磷酸果糖激酶路径不能合成这重要酶(EC 2.7.1.56) (Ross et al., 1991)。在A. xylinum纤维素合成是与氧化分解过程密切相关并消耗异化反应衍生的多达10%能量(Weinhouse, 1977)。细菌纤维素产生不受其它同化过程包括蛋白合成的干扰(Ross et al., 1991)
6.A. xylinum碳代谢路径。CS,纤维素合成(EC2.4.2.12),FBP,果糖-1,6-二磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.11)GK,葡糖激酶(EC 2.7.1.2); G6PDH,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49); 1PFK,果糖-1-磷酸盐激酶(EC 2.7.1.56); PGI,磷酸葡萄糖异构酶;PMG, UDPGlc磷酸葡萄糖变位酶(EC 5.3.1.9); PTS,磷酸转移酶系统;UGP,焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9); Fru-bi-P,果糖-1,6--磷酸盐;Fru-6-P,果糖-6-磷酸盐;Glc-6(1)-P,葡萄糖-6(1)-磷酸盐;PGA,磷酸葡糖酸;UDPGlc,尿苷二磷酸葡萄糖。
A. xylinum能转换各种碳化合物,如已糖、甘油、二羟基丙酮、丙酮酸和二羧酸成为纤维素,通常有效率50%。后面化合物进入克雷布斯循环并由于草酸盐脱羧成丙酮酸盐经过糖异生转换到已糖,与甘油、二羟基丙酮类似,并且是戊糖磷酸循环的间体(图6
纤维素直接前体是UDPGlc,是一种常规路径的产物,常见于包括植物的很多生物,并涉及葡萄糖磷酸化到葡萄糖-6-磷酸盐(Glc-6-P),由葡糖激酶催化,接之这间体向Glc-α-1-P,异构化,由磷酸葡糖酸变位酶催化并且后面代谢物由UDPGlc焦磷酸化酶转化到UDPGlc。这*后的酶似在纤维素合成中介入重要酶之一,因为某些表型纤维素阴性突变物(Cel),特别缺乏这种酶(Valla et al., 1989),虽然它们表现有纤维素合成(CS)活性,纤维素合成的观察方法经过体外证实,Cel株无细胞提取物来催化(Saxena et al., 1989)。此外,不同A. xylinum菌株之间焦磷酸化酶活性有变化并且在*有效纤维素产生菌测定有*高活性,如A. xylinum ssp. Sucrofermentans BPR2001。这后者菌株喜欢果糖作碳源,磷酸葡萄糖异构酶表现高活性,并且具有依赖磷酸烯醇丙酮酸盐磷酸转移酶系统。这系统刺激果糖向果糖-1-磷酸盐转换并促进果糖-16-二磷酸盐(图6
7.2.纤维素合成酶
纤维素在植物和原核生物的生物合成是由尿苷二磷酸盐(UDP)-形成CS催化的,主要是处置4-β-糖基转移酶(EC 2.4.1.12, UDPGlc: 1,4-β-葡聚糖4-β-D-葡萄基转移酶),因为它从UDPGlc向新形成多糖链连续输送吡喃葡萄糖残余物并所有时间都与这链连接。低聚CS复合物常被叫作末端复合物(TCs)。它被假设,TCs首先负责β-1,4-葡聚糖链合成,通过外膜挤出(如果是球状,CS催化域是定位在细胞膜的胞浆侧),并联合和晶体化为明确的超分子结构,跟随头两个过程。
A. xylinum纤维素合成是典型膜-固定蛋白,分子量400–500 kDa (Lin and Brown, 1989),并于胞浆膜紧密结合。
因为这个定位,CS纯化是非常困难的并且膜组分的分离必须在CS溶解和纯化之前进行。
而且,A.xylinum CS表明是一种很不稳定的蛋白(Lin and Brown, 1989)。从膜分离CS是应用洋地黄皂甙(Lin and Brown, 1989)或是洗涤剂(Triton X-100)进行的并用胰蛋白酶处理(Saxena et al., 1989),接之在纤维素中截留CS
按照Lin and Brown (1989)所述,纯化CS制剂在三种不同型亚单位中含有,分子量在90, 67, and 54 kDaSaxena et al. (1989)发现只有两型多肽(83 and 93 kDa).。这后面结果似更可信,因为这两个亚单位大小与Saxena et al. (1990b, 1991)CS操纵子测定的两个基因cesA cesB的大小及由Wong et al. (1990) and Ben-Bassat et al. (1993)对同样操纵子(see Section 7.4).报道的基因bcsA bcsB是相符的。
光化学亲和研究指出83-kDa多肽是一种催化亚单位,显示有高亲和力倾向UDPGlc (Lin et al., 1990)。根据基因序列,它含有723氨基酸残基,多是疏水的。这亚单位可能合成蛋白原,含有单一序列,由24个氨基酸残基组成,在制造加工期间截断(Wong et al., 1990)。成熟蛋白是靠近多肽链的N-末端以跨膜螺旋方式在细胞膜固定的。蛋白含有5个以上跨膜螺旋线,能相互和与在细胞质中潜入球型区域组成的一大的催化位点相作用。
Brown and Saxena (2000)主张A. xylinum CS的催化亚单位以同样方式操作次系加工糖基转移酶,即它在纤维素催化配糖直接结合合成,在异头碳构型同时反转来协助,来自UDPGlcα-构型,对多糖β-构型是单体供体。催活天冬氨酸残基(D),和在许多加工糖基转移酶的球形碎片中发现短序列DXD QXXRW
(Saxena and Brown, 1997)。在A. xylinumCS测到同样运动。在许多配糖合酶这球形碎片有两个区域特征(即由两个区域<
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